分枝DNA訊號放大技術英文branched DNA縮寫b-DNA),是一種訊號放大技術,可用於檢測DNA及RNA,不同於一般是用PCR擴增目標序列,b-DNA並沒有擴增序列,也因此不易受汙染產生的非專一性序列影響,也比PCR更能忍受目標序列變異造成的影響 ,目前常用於監控HIV及HCV病毒載量[1][2]

原理

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在固定支撐物上(如96孔盤)固定捕捉探針,再加入叫抓取擴展分子(Capture extender,CEs)的寡核苷酸,它用來抓取目標物並將其固定在固定支撐物,之後加入樣品讓CEs雜交抓取固定住,接著加入標籤擴展分子(Label extenders,LEs)(為靶序列專一性寡核甘酸)結合標定。

此技術可分為一代及二代、三代,第一代中,LEs結合分枝DNA訊號放大分子(branched DNA amplifier,bDNA),bDNA再結合數個鹼性磷酸酶探針(alkaline phosphatase probe),而在二代及三代LEs則是先結合了前置訊號放大分子(preamplifier),再結合bDNA,能得到更強的訊號放大,使靈敏度再提升,能偵測到更微量的目標物(從一代的10000提升至500),但也因此可能有非專一性雜交反應產生(如bDNA、preamplifier、鹼性磷酸酶探針和非靶序列雜交),會提升背景值。可在設計前述三者時加入30%的異鹼基:異胞嘧啶(isocytidine,isoC)及異鳥苷酸(isoguanosine,isoG),這些含異常核苷酸的分子不會和任何正常DNA序列有交互作用,故不會有背景值干擾的問題[3]

最後加入鹼性磷酸酶的螢光受質(如ELF 97、X-Phos)產生化學冷光(chemiluminescence)並使用冷光儀偵測螢光訊號[1]

參考資料

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  1. ^ 1.0 1.1 Takahashi, Tadanobu; Otsubo, Tadamune; Ikeda, Kiyoshi; Minami, Akira; Suzuki, Takashi. Histochemical imaging of alkaline phosphatase using a novel fluorescent substrate. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2014, 37 (10): 1668–1673 [2019-02-09]. ISSN 1347-5215. PMID 25109307. (原始内容存档于2019-02-09). 
  2. ^ Battersby, Thomas R.; Surtihadi, Johan; Rampersad, Vinod; Kleshik, Felix; Cosenza, Carlo; Canchola, Jesse A.; Brooks, Jesse R.; Beas, Hilda; Zhang, Nan. A Sensitive Branched DNA HIV-1 Signal Amplification Viral Load Assay with Single Day Turnaround. PLOS ONE. 2012-03-27, 7 (3): e33295 [2020-12-21]. ISSN 1932-6203. doi:10.1371/journal.pone.0033295. (原始内容存档于2019-04-27) (英语). 
  3. ^ Ho, David D.; Urdea, Mickey S.; Bushnell, Steve; Kolberg, Janice; Shen, Lu-Ping; Detmer, Jill; Ahle, David; Horn, Thomas; Chang, Chu-an. A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml. Nucleic Acids Research. 1997-08-01, 25 (15): 2979–2984 [2019-02-09]. ISSN 0305-1048. doi:10.1093/nar/25.15.2979. (原始内容存档于2022-03-02) (英语).